Определение соответствия эпитопов антигенов РЕСАН индивидуальным опухолевым антигенам человека

Аналитическая система определения соответствия иммунодоминантных эпитопов антигенов РЕСАН индивидуальным опухолевым антигенам человека

1 тест 2 х 2

Тест определяет выделение гамма-интерферона (ИФН-γ) из лейкоцитов свежей гепаринизированной крови под действием имитаторов опухолевых антигенов РЕСАН. Гамма-интерферон продуцируется преимущественно Т-лимфоцитами, натуральными киллерами, а также В-лимфоцитами в ответ на опасные для организма антигены. Когда указанные клетки имеют дополнительный повторный контакт с аналогичным антигеном, то усиливают синтез и выделение в окружающую среду гамма-интерферона. Если иммунодоминантные эпитопы имитатора опухолевых антигенов РЕСАН соответствуют иммунодоминантным эпитопам опухолевых антигенов конкретного человека, то синтез гамма-имтерферона увеличится на 20% и более.

Циклоспорин А, метотрексат, дексаметазон, 1-альфа, 25-дигидрокси витамин Д3 ингибируют синтез гамма-интерферона и должны быть отменены не менее чем за 7 дней до теста.

Определение гамма-интерферона проводят твёрдофазным иммуноферментным анализом с использованием тест системы для количественного определения (QuantiFERON®- Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia; A-8752 «гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ», ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск, Россия; и другие).

РЕАГЕНТЫ
Микропробирка R1 - содержит 0,5 мг порошка имитатора опухолевых антигенов.
Микропробирка R2 - содержит 0,5 мг порошка имитатора опухолевых антигенов.
Микропробирка C1 – пустая.
Микропробирка C2 – пустая.

ПРИМЕНЕНИЕ
Подготовку клеток больного для проведения теста проводят следующим образом: утром натощак, берут 10 мл крови из вены в узкую пробирку с гепарином (20 единиц гепарина на 1 мл крови). Содержимое пробирки тщательно перемешивают. Кровь отстаивают в узкой пробирке до момента чёткого отделения эритроцитов от плазмы (60 минут). 2 мл плазмы, богатой лейкоцитами, снимают и переносят в новую пробирку. Содержимое пробирки с плазмой тщательно перемешивают перед добавлением в микропробирки R1, R2, C1 и C2.

В микропробирки R1, R2, C1 и C2 добавляют по 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия и по 0,4 мл плазмы. Микропробирки закрывают и тщательно перемешивают через каждые 5 минут в течение первых 15 минут. Помещают микропробирки в термостат, смеси инкубируют при 370С в течение 16-24 часов.

Через 16-24 часа микропробирки извлекают из термостата и центрифугируют при 1000 об/мин 5 минут. Надосадочную жидкость используют для определения ИФН-γ .

Результат определения гамма-интерферона в пробах R1, R2, C1 и C2 твёрдофазным иммуноферментным анализом выражают в абсолютных значениях - МЕ/мл, либо в пг/мл.

Если содержание ИФН-γ в пробах C1 и C2 равна или больше чем в R1 и R2, тест отрицательный. Если содержание ИФН-γ в пробах R1 и R2 больше, чем в C1 и C2, расчет ведут по формуле:

((R1+R2)/2 - (C1+C2)/2))/(C1+C2)/2) х 100%

где:
R1– содержание ИФН-γ в мл надосадочной жидкости опытной Микропробирки R1;
R2– содержание ИФН-γ в мл надосадочной жидкости опытной Микропробирки R2;
C1– содержание ИФН-γ в мл надосадочной жидкости контрольной Микропробирки C1;
C2– содержание ИФН-γ в мл надосадочной жидкости контрольной Микропробирки C2.

Превышение содержание ИФН-γ в опыте меньше, чем на 20% по сравнению с контролем, тест отрицательный. Увеличение содержания ИФН-γ в опыте более, чем на 20% по сравнению с контролем, указывает на положительный тест и соответствие иммунодоминантных эпитопов имитатора опухолевых антигенов РЕСАН иммунодоминантным эпитопам опухолевых антигенов этого человека.

Результат теста выражают в проценте прироста ИФН-γ или плюсах:
+ прирост содержания ИФН-γ от 20 до 40%;
++ прирост содержания ИФН-γ от 40 до 60%;
+++ прирост содержания ИФН-γ от 60 до 80%;
++++ прирост содержания ИФН-γ на 80% и более

При исходно высоком содержании ИФН-γ в контроле (более 60 пг/мл) реакция может быть ложноотрицательной.

Если содержание ИФН-γ в контроле 0 пг/мл (или 0 МЕ/мл), а содержание в пробах и R1 и R2 больше 0,025 пг/мл (или 0,35 МЕ/мл), то реакция положительная.

Срок годности набора реагентов – 24 месяца со дня выпуска.

Гамма-интерферон (γ -interferon, IFN-γ) - инструкция

Рекомбинантный гамма-интерферон, обладающий свойствами природного, получен из штамма-продуцента E. coli, в который встроена
плазмида, несущая рекомбинантный ген человеческого лейкоцитарного гамма-интерферона. В рекомбинантном гамма-интерфероне,
состоящим из 144 аминокислот, в отличие от природного, N-концевые остатки трех аминокислот (Cys-Tyr-Cys) заменены на
аминокислоту Met, и он не гликозилирован.

Инъекционная лекарственная форма препарата представляет собой однородную пористую массу или порошок белого или кремового
цвета, хорошо растворимый в воде. Водный раствор препарата бесцветен или имеет желтоватый оттенок, прозрачен либо со слабой
опалесценцией. В качестве стабилизатора содержит поливинилпирролидон, полиглюкин или реополиглюкин.

Технология получения рекомбинантного человеческого иммунного интерферона гамма-типа заключается в культивировании
штамма-продуцента E. coli с последующими выделением и очисткой путем денатурации, ренатурации и хроматографией.

Назначение
Гамма-интерферон применяют для коррекции нарушений клеточного иммунитета, а также для лечения инфекционных, аутоиммунных,
аллергических и онкологических заболеваний.

Применение
Для коррекции клеточного звена иммунитета человека необходимо сделать иммунологический анализ с определением уровней
лейкоцитов, лимфоцитов (общий), В-, Т- и NK-клеток, уровни иммуноглобулинов А-, М- ,G- и Е- (общий), фагоцитарную активность,
комплемент-связывающую активность и скорость оседания эритроцитов. В зависимости от отклонений в иммунном статусе человека
выбирается тактика назначения доз и длительность курса лечения гамма-интерфероном.

Препарат "Гамма-интерферон" можно применять в сочетании с другими цитокинами (альфа-интерферон, фактор некроза опухолей,
интерлейкин-2, колониестимулирующие факторы и др.), при этом он оказывает усиливающий эффект на действие цитокинов.

Препарат "Гамма-интерферон" наиболее эффективен при применении на ранних стадиях заболеваний и рекомендован для применения в составе комплексной терапии на поздних стадиях заболеваний.

Содержимое флакона (ампулы) растворяют в 1 мл стерильной дистиллированной воды и вводят внутримышечно. Вскрытые и
неиспользованные флаконы (ампулы) можно хранить при температуре не выше 4°С не более 12 часов, замораживание не допускается.

Противопоказаний для применения препарата нет.

Побочные эффекты
При парентеральном введении гамма-интерферона возможны озноб, повышение температуры, утомляемость, кожные высыпания и зуд. При обкалывании очага поражения – местная воспалительная реакция. Эти побочные явления обычно не являются препятствием для продолжения применения гамма-интерферона.
При местном применении препарата на слизистой оболочке возможны конъюнктивальная инъекция, гиперемия слизистой глаза, единичные фолликулы, отек конъюнктивы нижнего свода. При резко выраженных местных и общих побочных реакциях введение гамма-интерферона следует прекратить.

Форма выпуска
Гамма-интерферон выпускают в лиофилизированном виде во флаконах или в ампулах. Содержание активного гамма-интерферона – 300 тыс МЕ, 500 тыс МЕ и 1 млн МЕ в 1 флаконе (ампуле).

Гамма-интерферон нужно хранить в темном сухом месте при температуре не выше 4°C. Срок годности препарата 2 года.